锐谈 | Nat. Commun.:基于蒽酚还原酶的催化机制解析与结构改造实现了单一手性复杂羟基环酮和β-卤代醇的高效合成

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开云官方入口：2023-10-16 10:36
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前手性酮的不对称还原，特别是以2,2-二取代-1,3-环二酮为原料去对称化反应合成光学纯的2，2-二取代-3-羟基环酮是一项具有挑战性的工作。江南大学生物工程学院饶义剑教授团队基于前期对贝第高林（Beticolin）生物合成路径的解析，鉴定出一种能够催化还原包括大黄素在内的多种大位阻底物的蒽酚还原酶CbAR，并首次解析了CbAR和CbAR-大黄素复合物的晶体结构。

1、序列同源性分析

从尾孢菌中挖掘到一种潜在的蒽酚还原酶CbAR，它与包括17β-HSDcl在内的几种典型的蒽酚还原酶具有很高的序列同源性(图1b)。以1a为底物进行反应，结果表明2a的转化率为99%，ee>99%(图1a-c)。因17β-HSDcl可以催化雌酮(1b)的还原，作者还测试了CbAR是否能催化还原雌酮。如图1d所示，CbAR可以将1b及其类似物(1c，1d)转化为相应的雌二醇。由于2,2-二取代-3-羟基环酮是雌酮的一种合成砌块，因此CbAR具有催化前手性2，2-二取代1，3-环二酮生成相应手性醇的潜力。

2、CbAR和CbAR-大黄素复合物晶体结构的解析

CbAR单体的结构包含9个α-螺旋和2组β-Sheet(β1-β7)(图2-1a)。单体结构比对结果表明，虽然CbAR和CbAR-大黄素复合物的Cα原子的rmsd为0.25，但aa209-216的loop区域明显不同(图2-1b)。这一区域在CbAR-大黄素复合物的结构中可见，而在CbAR结构中观察不到，表明该区域在底物识别和结合中起着关键作用(图2-1c)。晶体结构及体外实验表明，除了催化三联体(Ser151，Tyr165和Lys169)外，Asn152、His162, Tyr210, Pro212和Pro219在大黄素的底物识别、结合和稳定中也起着关键作用(图2-2)。

3、CbAR的结构改造

CbAR可以适应不同的大位阻底物，但催化效率较低，经过基于结构的蛋白质工程改造，作者选择活性最高的CbAR-H162F突变体进行了底物范围的探索。结果表明H162F对于几种2，2-二取代-1，3-环二酮的底物都有较好的转化率和极高的立体选择性(图3a-b)。随后，通过H162F-1e复合物的晶体结构揭示了H162F催化这类底物的分子机制(图3c-d)。