基于转录因子的生物传感器通常用于代谢工程中基因表达的诱导控制以及相关应用，例如高通量筛选和动态调控，因此挖掘新的转录因子至关重要。PadR是一种酚酸响应性转录抑制因子，最早在枯草芽孢杆菌中发现，PadR可以抑制启动子PpadC及其下游编码的酚酸脱羧酶基因（padC）的表达，当细胞暴露于酚酸积累的环境中时，酚酸会与PadR结合，导致PadR构象发生变化，解除对padC转录的抑制，激活酚酸的脱羧作用。由于该调节器能够检测对香豆酸和阿魏酸等重要酚酸化合物，因此其作为代谢工程和合成生物学中的生物传感器已经被广泛研究和探索。
最近，美国佐治亚大学闫亚军团队在ACS Synthetic Biology上发表了名为“Identifying, Characterizing, and Engineering a Phenolic Acid-Responsive Transcriptional Factor from Bacillus amyloliquefaciens”的文章。该研究发现了来自解淀粉芽孢杆菌中的新型酚酸响应转录因子BaPadR，揭示了其独特的配体特征，并通过BaPadR调节器的定点诱变和BaPadR结合盒的碱基改变扩大了其动态范围并提高了其灵敏度，扩展了当前小分子传感转录因子库，并为生物传感器工具箱作了有用补充。
闫亚军团队基于对枯草芽孢杆菌的BsPadR的深度研究，找到了解淀粉芽孢杆菌中对应的BaPadR序列以及BaPpadC启动子的序列，随即在大肠杆菌中重建了BaPadR-BaPpadC传感器系统。将BaPadR构建在pCS27中IPTG诱导型的pLlacO1启动子上，BaPpadC启动子用于控制报告基因egfp的表达，生成pCS-BaPadR和pHA-BaPpadC-WT-egfp双质粒，并共同转入大肠杆菌。
结果表明，BaPpadC启动子的活性极低，且对BaPadR和p-香豆酸没有任何响应，他们猜测可能是由BaP padC启动子上的天然RBS 活性较低所致，添加强RBS后BaPpadC-RBS表现出高活性。但是当BaPadR表达被0.5 mM IPTG诱导时，启动子活性急剧下降，且进一步添加p-香豆酸也不能解除这种抑制，他们猜测可能是由于PadR的高表达水平所致，因此，为了减少BaPadR表达，他们通过微调IPTG浓度来调整 pLlacO1启动子的活性，最终证明了该传感器系统的成功重建并验证了BaPadR的功能，且当IPTG浓度设置为2.5 μM时，600 mg/L p-香豆酸可以释放近60%的抑制。
随后，他们团队进一步分析了该传感器系统的配体范围，并且通过与BsPadR进行序列对比发现，BaPadR中底物结合区域（A107-D145区域）存在不同的氨基酸序列，因此他们推测BaPadR可能具有不同的配体谱。最终确定p-香豆酸具有最佳的诱导效果，600 mg/L的p-香豆酸能够导致egfp的表达水平增加3.36倍，其次是阿魏酸（2.58倍）、水杨酸（1.56倍）和咖啡酸（1.40倍）。
从研究结果可知添加酚酸类化合物并不能完全解除BaPadR对BaPpadC启动子的抑制，他们猜测BaPadR的高抑制效率可能是由于BaPadR与启动子BaPpadC之间的高结合亲和力所致。他们基于对BsPadR的DNA结合区域进行工程设计的研究基础，针对BaPadR设计并构建了六个BaPadR突变体（H38I、H38E、H38N、H38D、H38S和H38A），其中S39A 变体将BaPadR-BaPpadC生物传感器系统使动态范围增加了1.71倍，并且对最佳突变体S39A进行了底物范围的测试，p-香豆酸仍然表现最好，在600 mg/L诱导剂浓度下，导致egfp表达水平增加7.55倍，其次是阿魏酸（6.50倍）、咖啡酸（4.30倍）、水杨酸（2.33倍）和肉桂酸（1.53倍）。
除此之外，闫亚军团队还通过启动子截短和混合启动子构建鉴定了潜在的 PadR在BaPpadC启动子中的DNA结合盒。
通过对比BsPadR的DNA结合序列，找到了BaPadR的潜在DNA结合序列
（BaPadR-1：“-CATGTAAATAGTTACATG-”，
BaPadR-2：“-CATGTATATAATAAACATA-”）
随即他们设计了四个截短的启动子（Trunc1-4），测试消除潜在的结合序列后启动子是否仍然可以响应BaPadR和p-香豆酸，最终证实了两个负责与BaPadR识别的DNA序列，并且BaPadR-1为主要的识别和结合序列。
为了进一步验证BaPadR结合盒的功能并研究这两个DNA结合序列是否可以以“即插即用”的方式使用，他们试图通过将结合序列插入到不能被调控的启动子中来设计混合启动子，用BaPadR结合盒取代LacO的位置1和2将使BaPadR识别杂合启动子并抑制下游报告基因的转录。通过在不同位置替换两个结合盒，共设计了4个混合启动子（Phy11、Phy12、Phy21和Phy22），同时为了考虑到两个BaPadR结合盒在原始启动子中是重叠的还设计了两个额外的杂合启动子（Phy35和Phy10）。
结果表明，BaPpadC启动子表现出比pLlacO1启动子更高的活性，表明其在合成生物学和代谢工程中的应用具有巨大潜力，同时Phy12保持了与pLlacO1相当的启动子活性，并且BaPadR可以抑制Phy12约82.8%的启动子活性。添加600 mg/L p-香豆酸后，启动子活性可恢复约29.7%。
除此之外，他们还测试了6个混合启动子针对S39A变体的动态性能BaPadR对Phy12和Phy21启动子的抑制效率分别变为77.4%和49.2%，但这两个启动子对对香豆酸的响应得到改善。通过 600 mg/L的p-香豆酸诱导，可以恢复大约 63.4% 和 68.5% 的启动子活性。
随着BaPadR结合盒的表征，他们希望进一步降低调节子和启动子之间的结合亲和力，并研究结合盒中核苷酸改变对整个传感器系统输出的影响。他们基于对BsPadR的研究，对BaPadR的BaPadR-1结合序列的C6、T8和T18进行单碱基突变，并获得了多个碱基突变的启动子，最终PpadC-T18C、Phy12-C6A和 Phy12-C6T能够被600 mg/L的 p-香豆酸完全诱导。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00206
作者：桃子
